Electrophysiology of Cardiac Mitochondria
The main objective of MITOCARD is to lead to a major progress in the understanding of cardiac physiology by integrating the mitochondrial properties of cell signaling in the comprehensive view of cardiac energetics and rhythm pathologies. It was recently demonstrated that in the heart, in striking contrast with skeletal muscle, a parallel activation by calcium of mitochondria and myofibrils occurs during contraction, which indicates that mitochondria actively participate to Ca2+ signaling in the cardiomyocyte. We hypothesize that the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), by rhythmically depolarizing inner mitochondrial membrane, plays a crucial role in mitochondrial Ca2+ regulation and, as a result, of cardiomyocyte Ca2+ homeostasis. Moreover, mitochondrial ROS may play a key role in the regulation of the mPTP by “sensing” mitochondrial energetics balance. Consequently, a deeper understanding of mitochondrial “electrophysiology” is mandatory to decipher their exact role in heart excitation-contraction coupling processes. However, this is currently prevented by the absence of adequate methodological tools (lack of sensitivity or selectivity, time resolution, averaged responses of numerous biological entities); we propose to solve that issue by developing innovative analytical tools and biophysical approaches to monitor kinetically and quantitatively the Ca2+ handling by isolated mitochondria in the cardiomyocyte.
MITOCARD is a multi-disciplinary project involving 4 partners of different scientific fields. Two partners (ISM, LAAS) will develop devices and methods to monitor in real-time key mitochondrial signaling parameters: Ca2+, membrane potential, quinone reduction status, O2 consumption, ROS production. We plan to monitor activities at different biological levels, from small populations of mitochondria, then on isolated cells, while targeting the single unit level so as to measure exact fluxes and kinetics of metabolites. To reach these goals, we will first develop chips integrating 4 different electrochemical microsensors. These will allow to measure simultaneously on the same mitochondria or cells their O2 consumption, quinone reduction status and ROS production (ISM, CRCTB, LAAS). Subsequently, highly innovative microwell arrays integrating ring nanoelectrodes will be developed to trap single mitochondria within micrometric chambers and measure locally by combined fluorescence microscopy and electrochemical techniques intra- (by fluorescence) and extra-mitochondrial (electrochemistry) metabolites. This approach should demonstrate the direct correlations between energetics, redox signaling and calcium handling via the PTP on a single biological entity (CRCTB, CARMEN).
Mitochondria from two different origins, i.e. from the rat heart and skeletal muscle because of their mechanistic differences will be challenged with diverse activators and inhibitors of calcium transport, respiratory chain and ROS production. We will further switch from the level of isolated mitochondria to a single myocyte (CRCTB, ISM), so as to evaluate general integrated behaviors of mitochondrial populations interacting with cell structures (SC in particular for calcium). We aim also at working on a cell in physiological conditions, meaning a beating cell whose contraction is not pharmacologically inhibited. This approach will necessitate the adaptation of methodologies to measure sufficiently rapidly and locally the dynamics of calcium, quinone, ROS, and oxygen. All these unprecedented data will stimulate the development of a new numerical dynamic model of excitation-contraction coupling by including mitochondrial electrophysiology (CARMEN). The model may serve both to assess biological assumptions on the role of mitochondria in Ca2+ signaling and to integrate pathological data and provide clues for their global understanding.
Electrophysiologie de la Mitochondrie Cardiaque
L’objectif principal du projet MITOCARD est de conduire à des progrès majeurs dans la compréhension de la physiologie cardiaque, en intégrant les propriétés mitochondriales de signalisation cellulaire dans les mécanismes énergétiques du cœur. Il a été en effet démontré que dans le muscle cardiaque, à la différence du muscle squelettique, l’activation par le calcium des mitochondries et des myofibrilles a lieu en parallèle, ce qui indique que les mitochondries participent activement à la signalisation calcique du cardiomyocyte. Nous posons l’hypothèse que le pore transitoire de perméabilité mitochondrial (mPTP), en dépolarisant de façon rythmée le potentiel de membrane, joue un rôle crucial dans la régulation calcique du cardiomyocyte. De plus, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) au sein de la mitochondrie peut jouer un rôle régulateur du PTP, fonctionnant comme un senseur de la balance énergétique. Par conséquent, une compréhension approfondie de l’électrophysiologie mitochondriale devient nécessaire pour mieux définir le rôle de ces organites dans les processus d’excitation-contraction cardiaque. Ceci est à l’heure actuelle principalement empêché par des limitations méthodologiques (sensibilité ou sélectivité des analyses, temps de résolution insuffisant, valeurs moyennes). Nous proposons de lever ces verrous en développant une nouvelle génération d’outils analytiques pour mesurer quantitativement et résoudre cinétiquement la régulation calcique par les mitochondries dans le cardiomyocyte.
MITOCARD est un projet multidisciplinaire impliquant 4 équipes de domaines scientifiques différents. Deux partenaires (ISM, LAAS) développeront des systèmes et méthodes pour suivre en temps-réel des paramètres de la signalisation mitochondriale : Ca2+, potentiel de membrane, état redox des quinones, consommation d’O2 et production de ROS (H2O2). Nous travaillerons à deux échelles biologiques différentes, depuis de faibles populations de mitochondries jusqu’à des cellules isolées, en visant une analyse sur entité unique pour mesurer les vrais flux métaboliques. Pour cela, nous développerons d’abord des puces intégrant 4 capteurs électrochimiques afin de faire une analyse multiparamétrique (O2, quinones, ROS) simultanée sur une même population de mitochondries (ISM, CRCTB, LAAS). Ensuite, nous développerons des réseaux de micropuits intégrant des nanoélectrodes annulaires, permettant de piéger des mitochondries individuelles dans des microchambres et de mesurer in situ par fluorescence et électrochimie combinées, des métabolites intra- et extra-mitochondriaux. Cette approche extrêmement novatrice devrait permettre de démontrer les corrélations directes entre l’énergétique, la signalisation redox et la régulation calcique via le PTP sur une même entité biologique (CRCTB, CARMEN).
Des mitochondries de deux origines différentes, le muscle cardiaque et le muscle squelettique de rat, seront comparées quant à leur réponse aux activateurs-inhibiteurs du transport calcique, de la chaine respiratoire et de la production de ROS. Nous transposerons nos études à l’échelle de la cellule unique, le myocyte, pour évaluer les interactions de la mitochondrie avec les autres structures de la cellule (en particulier le SC pour le calcium). Nous avons aussi pour but de travailler en condition physiologique, sur des cardiomyocytes battants, en adaptant nos méthodes pour mesurer sans contrainte temporelle les cinétiques calciques, de potentiel de membrane et les ROS. Les données obtenues seront assurément inédites, elles alimenteront un nouveau modèle numérique simulant le couplage excitation-contraction de la cellule cardiaque, en intégrant l’électrophysiologie mitochondriale (CARMEN). Le modèle devrait permettre de valider les hypothèses biologiques sur le rôle mitochondrial dans la régulation calcique cardiaque, afin d’intégrer à terme des données sur les processus pathologiques et fournir des clés de compréhension et prévision biomédicales.